如何实现真核生物一蛋白基因在大肠杆菌细胞中受控、稳定、分泌和高效表达。

题目

相似考题

1.真菌在微生物中属A、原核细胞型微生物B、真核单细胞型微生物C、真核多细胞型微生物D、非细胞型微生物E、真核单细胞型微生物和多细胞型微生物

3.原核生物和真核生物翻译起始的不同之处在于( )。A.真核生物先靠shine-Dalgarno序列使mRNA结合蛋白体 B.真核生物帽子结合蛋白是翻译起始因子之一 C.原核生物和真核生物使用不同的起始密码子 D.真核生物mRNA与核蛋白体小亚基蛋白rpS-1识别结合 E.原核生物有TATAAT作为翻译起始序列，真核生物则是TATA

4.原核生物和真核生物翻译起始的不同之处在于( )。A、原核生物有TATAAT作为翻译起始序列，真核生物则是TATAB、真核生物无靠shine-Dalgarno序列使mRNA结合蛋白体C、原核生物和真核生物使用不同的起始密码子D、真核生物帽子结合蛋白是翻译起始因子之一E、真核生物mRNA与核蛋白体小亚基蛋白rpS-1识别结合

参考答案和解析

正确答案: 大肠杆菌是高效表达异源蛋白最常用的原核表达系统。由于每种基因都有其独特的结构、mRNA的稳定性和翻译效率、蛋白质折叠的难易程度，修主细胞蛋白酶对蛋白质的降解等等原因，因此并非每一种基因都能在大肠杆菌中有效表达。下面浅谈一下实现真核生物一蛋白基因在大肠杆菌细胞中受控、稳定、分泌和高效表达的策略。
首先，要构建有效的表达载体，一种高效的原核表达载体需要包括一个强大并且可以严紧调节的启动子；一位于翻译起始密码子5’端大约9bp的SD序列；位于目的基因3’末端的一个高效转录终止子。除此之外，载体还需要一个复制起点，筛选标记和利于对启动子活性进行严紧调节的基因。这种调节元件可以插入载体自身，也可以插入宿主的染色体。其他的元件包括转录和翻译增强子等。这些元件的作用往往具有基因特异性，因此要根据不同的情况加以取舍。构建表达载体，需要仔细考虑多种元件的组合，以保证最高水平的蛋白质合成。
a、提高转录水平调控的策略
（1）选择的启动子要具有适合高水平蛋白质合成的某些特性。首先启动子的作用要强；第二，它必须表现最低水平的基础转录活性。若要求高效的基因表达，最好选用高密度培养细胞和表现最低活性的可诱导和非抑制启动子。
（2）现在已鉴定了一些在E.coli中显著增强异源基因表达的序列，有可能利用增强子来达到超量表达蛋白质的目的。（3）虽然转录终止子在表达质粒的构建过程中常被忽略，但有效的转录终止子是表达载体必不可少的元件。
b、提高翻译水平调控的策略
（1）mRNA5’末端的独特结构是mRNA翻译起始效率的最主要决定因素，因此找到通用的有效起始翻译的共同序列能高效起始外源蛋白的翻译。
（2）SD与起始密码子间的距离约为5-13bp，这一距离影响翻译起始的效率，因此在设计载体中要控制好这段距离。（3）在mRNA的翻译起始区的二级结构在决定基因表达效率方面具有重要作用，使用一些策略使mRNA形成二级结构的可能性最小。
（4）mRNA的快速降解势必影响蛋白质的产生，比如可以通过选用缺乏某些特定RNase如RNaseII或PNPase的宿主菌来提高基因的表达，这将在E.coli高效表达外源基因中有很大作用。
（5）在mRNA中存在终止信号是翻译终止过程必不可少的，在设计表达载体时，通常插入三个终止密码子以防止核糖体的跳跃，在E.coli中偏向于使用UAA密码子。
c、维护真核生物蛋白基因在大肠杆菌细胞稳定性和减少E.coli中重组蛋白裂解的策略
（1）将蛋白质靶向细胞周质或培养基
（2）在较低的温度下培养细菌
（3）选用蛋白酶缺陷的菌株
（4）构建N-末端或C-末端融合蛋白；融合系统能够产生大量的可溶性的融合蛋白，为E.coli中高效表达和纯化重组蛋白提供了极大方便。
（5）将目的基因多拷贝串联
（6）与分子伴侣共表达
（7）替换特定的氨基酸残基以消除蛋白酶裂解位点
（8）改善蛋白质的亲水性
（9）优化培养条件，E.coli中的蛋白质产量可以通过高细胞密度培养系统而获得显著提高，
d、提高真核生物蛋白基因在大肠杆菌细胞分泌的策略
（1）将蛋白质分泌到细胞外是人们最期望的一种策略。因为这样容易纯化目的蛋白质，减少细菌的蛋白酶对目的蛋白质的裂解。但是，E.coli在正常情况下只有很少量的蛋白质分泌到细胞外。在大肠杆菌表达系统中，金黄色葡萄球菌A蛋白的信号肽能引导带有E结构域的A蛋白片段或融合产物从细胞质外泌到培养基中，如果能利用可控的强启动子进行A蛋白信号肽引导的基因表达，则有望在蛋白质外泌方面有所突破。
（2）对培养基的特殊操作能明显提高蛋白质释放到培养基中。例如，在培养基中添加甘氨酸能增强外周质蛋白释放到培养基中，且不引起明显的细菌裂解。
质粒的构建，SD序列，信号肽，糖基化，启动子

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第1题：

下列关于原核生物和真核生物的叙述，正确的是（）
- A、真核生物细胞进行有氧呼吸，原核生物细胞进行无氧呼吸
- B、真核生物细胞进行有丝分裂，原核生物细胞进行无丝分裂
- C、真核生物以DNA为遗传物质，原核生物以RNA为遗传物质
- D、真核生物遗传可能遵循孟德尔遗传规律，原核生物不遵循
正确答案:D
第2题：

下列关于原核生物和真核生物的叙述，正确的是（）
- A、原核生物细胞不含线粒体，不能进行有氧呼吸
- B、真核生物细胞和原核生物细胞都能进行有丝分裂
- C、真核生物DNA为遗传物质，部分原核生物以RNA为遗传物质
- D、真核生物细胞具有生物膜系统，有利于细胞代谢高效有序地进行
正确答案:D
第3题：

由200个氨基酸组成的一种蛋白质，规定其结构的基因（）
- A、在原核生物中较长
- B、在真核生物中较长
- C、在原核生物和真核生物中一样长
- D、基因长度并不依赖于原核的还是真核的细胞组织状态
正确答案:B
第4题：

真核生物中组装RNApolⅡ起始复合物需要的蛋白质数比原核生物中转录起始复合物所需的蛋白质数多得多，最主要的原因是：（）
- A、真核生物中细胞专一性的调节要求转录受到严格调控，多基因的蛋白质复合物有利于这一需求的满足
- B、真核生物中的DNA结合蛋白质比原核生物多
- C、真核生物中的基因数比原核生物多
- D、真核生物启动子含有TATA框，原核生物启动子含有-35序列和-10序列
正确答案:A
第5题：

真核生物的细胞核具有（）（）和（）。微生物中（）和（）属于真核生物，而（）和（）则属于原核生物。

正确答案:核膜、核仁；典型染色体；酵母菌；霉菌；细菌；放线菌
第6题：

真核微生物包括的种类广泛，请指出下列（）生物属于真核微生物。
- A、原生动物
- B、病毒
- C、真菌
- D、大肠杆菌
- E、单细胞藻类
正确答案:A,C,E
第7题：

多细胞的真核生物比原核生物的基因表达调控更加复杂是因为（）
- A、在真核生物中，不同的细胞转化而执行不同的功能
- B、原核生物仅限于稳定的环境
- C、真核生物具有较少的基因，所以每个基因必须承担更多
- D、多细胞真核生物具有合成蛋白质所需的基因
正确答案:A
第8题：

大肠杆菌中编码一个酶的操纵子是（）的例子。
- A、酶在细胞中如何工作
- B、基因如何在细胞中调控
- C、细胞中蛋白质如何转变为能量化合物
- D、真核生物如何从原核生物进化
正确答案:B
第9题：

单选题
由200个氨基酸组成的一种蛋白质，决定其结构的基因（）。
A
在原核生物中较长
B
在真核生物中较长
C
在真核生物和原核生物中一样长
D
基因长度并不依赖于原核的还是真核的细胞组织状态

正确答案： B
解析：暂无解析
第10题：

单选题
真核生物与原核生物的差别在于：（）
A
真核生物没有细胞器
B
真核生物有细胞核和细胞器
C
原核生物有细胞核
D
真核生物不能通过有丝分裂进行分裂

正确答案： D
解析：暂无解析
第11题：

多选题
真核微生物包括的种类广泛，请指出下列（）生物属于真核微生物。
A
原生动物
B
病毒
C
真菌
D
大肠杆菌
E
单细胞藻类

正确答案： A,E
解析：暂无解析
第12题：

单选题
真菌在微生物中属（）
A
原核细胞型微生物
B
真核单细胞型微生物
C
真核多细胞型微生物
D
非细胞型微生物
E
真核单细胞型微生物和多细胞型微生物

正确答案： B
解析：暂无解析
第13题：

有关生物体内基因控制蛋白质合成的说法中错误的是（）
- A、原核生物和真核生物中决定氨基酸的密码子是相同的
- B、真核生物的基因控制合成的蛋白质中氨基酸的种类和数目比原核生物多
- C、在原核生物和真核生物中一种转运RNA都只能运载一种氨基酸
- D、原核生物和真核生物的转录都是在RNA聚合酶的催化作用下进行的
正确答案:B
第14题：

原核生物同真核生物最主要的差别是（）
- A、原核生物无定型的细胞核，真核生物则有
- B、原核生物的DNA是环状，真核生物的DNA是线状
- C、原核生物的基因遗传转录和翻译是耦联的，真核生物则是分开的
- D、原核生物没有细胞骨架，真核生物则有
正确答案:A
第15题：

无论在原核生物还是真核生物中，DNA复制均发生在（）。
- A、细胞分裂之前
- B、细胞核内
- C、在组蛋白周围
- D、细胞质内
正确答案:A
第16题：

简述原核细胞和真核生物蛋白质合成的主要区别。

正确答案:原核生物蛋白质合成与真核生物蛋白质合成的主要差别有：
（1）原核生物翻译与转录是偶联的，真核生物要将细胞核内转录生成的mRNA转运到细胞质才能进行蛋白质合成，因此，转录和翻不可能偶联。
（2）原核生物肽链的合成是从甲酰甲硫氨酰-tRNA开始的，真核生物的肽链合成是从甲硫氨酰-tRNA开始的。（3）原核生物肽链合成的起始依赖于SD序列，真核生物肽链合成的起始依赖于帽子结构。
（4）原核生物的mRNA与核糖体小亚基的结合先于起始tRNA与小亚基的结合，而真核生物的起始tRNA与核糖体小亚基的结合先于mRNA与小亚基的结合。
（5）在原核生物蛋白质合成的起始阶段，不需要消耗ATP，但真核生物需要消耗ATP。
（6）参与真核生物蛋白质合成起始阶段的起始因子比原核生物复杂，释放因子则相对简单。
（7）原核生物与真核生物在密码子的偏爱性上有所不同。
（8）真核细胞的翻译后加工比原核细胞复杂。
第17题：

真核生物和原核生物差别在于（）
- A、真核生物没有细胞壁
- B、真核生物有核膜
- C、原核生物没有细胞壁
- D、真核生物不能通过有丝分裂进行分裂
正确答案:B
第18题：

通常在原核生物如大肠杆菌的细胞里只有一个染色体，因而它们在DNA含量上远低于真核生物的细胞。

正确答案:正确
第19题：

真核生物与原核生物差别在于（）。
- A、真核生物没有细胞器
- B、真核生物有一个单个染色体
- C、真核生物有细胞核及细胞器
- D、真核生物不能通过有丝分裂进行分裂
正确答案:C
第20题：

如何提高真核基因在原核宿主中的表达效率？

正确答案: （1）选择合适载体，提高翻译水平
强启动子——提高转录水平
核糖体结合位点（ATG-SD）距离合适
在基因重组过程中应将结构基因接于SD序列之后．以便为mRNA提供核糖体结合位点，提高真核基因表达效率。
避免产物降解：分泌/融合表达；（融合蛋白表达后再去除原核肽段）
（2）选择合适宿主（如Lac启动子——LacI菌；PL/PR——CI857溶源菌）
（3）调节宿主细胞代谢
为保持宿主正常生长速度及重组转化体稳定性，维持产物的高效表达，必需采用适当方法，调节细胞代谢。目前，调节细胞代谢方法很多。如营养物浓度控制、产物诱导表达、载体诱导复制及促进产物分泌等。
第21题：

填空题
真核生物的细胞核具有（）（）和（）。微生物中（）和（）属于真核生物，而（）和（）则属于原核生物。

正确答案：核膜、核仁,典型染色体,酵母菌,霉菌,细菌,放线菌
解析：暂无解析
第22题：

单选题
真核生物和原核生物差别在于（）
A
真核生物没有细胞壁
B
真核生物有核膜
C
原核生物没有细胞壁
D
真核生物不能通过有丝分裂进行分裂

正确答案： D
解析：暂无解析
第23题：

单选题
真核生物中组装RNApolⅡ起始复合物需要的蛋白质数比原核生物中转录起始复合物所需的蛋白质数多得多，最主要的原因是：（）
A
真核生物中细胞专一性的调节要求转录受到严格调控，多基因的蛋白质复合物有利于这一需求的满足
B
真核生物中的DNA结合蛋白质比原核生物多
C
真核生物中的基因数比原核生物多
D
真核生物启动子含有TATA框，原核生物启动子含有-35序列和-10序列

正确答案： A
解析：暂无解析

如何实现真核生物一蛋白基因在大肠杆菌细胞中受控、稳定、分泌和高效表达。

题目

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