第22题:
问答题
何谓差别杂交和扣除杂交?举例说明用以分离基因的过程。
正确答案:
差别杂交(differential hybridization)又叫差别筛选(differentual screening),适用于分离经特殊处理而被诱发表达的mRNA之cDNA克隆。为了增加这种方法的有效性,后来又发展出了扣除杂交技术。扣除杂交(subtractive hybridization)又叫扣除cDNA克隆(subtractive cDNA cloning),它是通过构建扣除文库(subtractive library)得以实现的。
差别杂交的技术基础需要有两种不同的细胞群体:在一个细胞群体中目的基因正常表达,在另一个细胞群体中目的基因不表达。在这种情况下便可制备到两种不同mRNA提取物。其一是含有一定比例的目的基因mRNA种的总mRNA群体,其二是不含有目的基因mRNA种的总mRNA群体。通过这两种总mRNA(或是它们的cRNA拷贝)为探针的平行杂交,对由表达目的的基因的细胞总mRNA构建的克隆库进行筛选。当使用存在目的基因的mRNA探针时,所有包含着重组体的菌落都呈阳性反应,在X光底片上呈现黑色斑点;而使用不存在目的基因的mRNA探针时,除了含有目的基因的菌落外,其余的所有菌落都呈阳性反应,在X光底片上呈现黑色斑点。比较这两种底片并对照原平板,便可以挑选出含目的基因的菌落,供作进一步研究使用。 扣除杂交是用一般细胞的mRNA与特殊细胞的cDNA杂交,先扣除一般共有的cDNA,再交剩下特异的cDNA进行克隆。
下面以T 细胞受体(T-cell receptor,TCR;有时亦称之为T细胞抗原受体)编码工因的分离为例子,说明扣除杂交筛选法的基本原理与简要过程。TCR基因只能在T细胞中表达,而不能在B细胞中表达。从T细胞mRNA制备来的单链cDNA,同大大超量的B细胞的mRNA在有利于发生DNA-RNA杂交的条件下保温,所有的能够在T和B两类细胞中同时表达的T细胞基因的cDNA分子(约占98%),都能与B细胞的mRNA退火形成DNA-RNA杂交分子,而不能在B细胞中表达的、T细胞特有的cDNA(约占2%),由于B细胞中没有相应的mRNA,仍然处于单链的状态。将此种杂交混合物通过羟基磷灰石柱(hydroxylapatite column),于是DNA-RNA杂交杂分便结合在柱上,而游离的单链cDNA则过柱流出。如此回收入到的T细胞特异的cDNA被转变为双链cDNA之后,与适当的λ噬菌体载体重组并转染给大肠杆菌寄主细胞,这样便得到了T细胞持cDNA高度富集的扣除文库。然后再按照同样方法制备扣除的cDNA探针,即被B细胞mRNA杂交扣除了的T细胞特异的cDNA探针,筛选文库,结果成功地分离到了T细胞的TCR基因。
解析:
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