试述举2种质粒DNA提取的方法及应用。

第1题：

第2题：

第3题：

目前使用较为广泛的质粒DNA小量提取的方法是（）

• A、牙签少量制备法
• B、小量一步提取法
• C、SDS裂解法
• D、碱裂解法
• E、煮沸裂解法

正确答案:D

第4题：

简述质粒DNA的分离提取方法。

正确答案: （1）选择性抽提法，（2）碱性SDS法

第5题：

碱裂解法提取质粒DNA的原理，分析影响试验结果的各种可能因素。

正确答案: 碱裂解法原理：在碱性条件下，双连DNA氢键断裂，结构破坏变性，环状超螺旋质粒不充分变性。在中性条件下变性质粒恢复原来构型，而线性大分子细菌DNA不能复性呈不溶物而经离心除去。
（各种可能因素是上一届的，具体其实大家可以根据那天师兄说的去写）
提取失败：
1）洗去双链时，将质粒DNA洗去；
2）破壁失败，质粒没析出；
3）加剂问题
电泳失败：1）电压太高
2）没加染色剂
3）胶穿孔
4）电泳时间过长

第6题：

以大肠杆菌质粒DNA的提取和重组为例阐述基因工程的基本步骤。

正确答案:①从细胞中分离出DNA；
②限制酶截取DNA片段；
③分离大肠杆菌中的质粒；
④DNA重组；
⑤用重组质粒转化大肠杆菌；
⑥培养大肠杆菌克隆大量基因。

第7题：

简述质粒DNA纯化方法。

正确答案: （1）碱性蔗糖密度梯度离心法，（2）氯化铯-溴化乙錠密度梯度离心法，（3）硝酸纤维素膜吸附法

第8题：

第9题：

第10题：

第11题：

第12题：

第13题：

第14题：

有关煮沸裂解法提取质粒DNA的正确叙述是（）

• A、该法是一种条件比较温和的物理方法
• B、煮沸能完全灭活核酸内酶A
• C、不适用于大多数Ecoli菌株
• D、适用于HB101菌株
• E、适用于<15kb的质粒DNA制备

正确答案:E

第15题：

碱裂解法制备质粒DNA的方法有哪些？

正确答案: （1）接种菌落于含抗生素的LB中，37℃剧烈振荡反应；
（2）培养液4℃12000rpm30min离心；
（3）重悬细菌于100μl冰预冷的溶液I（50mM葡萄糖25mMTris-HCL（pH8.0），10mMEDTAPh8.0）中剧烈振荡；（4）加200μl亲配制液溶液II（0.2MNaOH1%SDS），混合内容物，不要振荡，置冰上；
（5）加150μl冰预冷溶液III（5MKac60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml），温和振荡10s置于阔步3-5min；
（6）40℃。12000rpm离心5min，转移上清；
（7）上清加等量酚；氯仿抽提，4℃，12000rpm离心2min，收集上清；
（8）加入2倍体积乙醇，振荡混合，室温放置2min；
（9）4℃，12000rpm，离心5min，弃上清；
（10）倒置离心管，倾干液体；
（11）1ml70%乙醇4℃洗涤沉淀，弃上清，空气中干燥10min；
（12）用500μl含无DNA酶的胰RNA酶（20μg/ml）的TE重新溶解核酸，振荡，贮于-20℃。

第16题：

小量制备质粒DNA，用质粒中特定的酶切发现切割不动，试分析可能原因及克服方法？

正确答案: 最可能的原因：从细菌沉淀或从核酸沉淀中吸上清时注意不够，带了杂蛋白。其最根本的原因是因为细菌的细胞壁成分或核内某些蛋白质可能抑制限制酶活性。克服方法：用酚氯仿对溶液抽提；用离心柱层析法纯化DNA。

第17题：

小批量碱变性提取质粒DNA的原理与基本过程如何？

正确答案: 碱变性法是常用的质粒抽提方法，其原理是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
小批量碱变性提取质粒DNA的基本过程为——
（1）酶或机械法等方法破坏细胞，释放出胞内物质；
（2）加碱使DNA与蛋白质变性，加中和液复性。因为质粒DNA分子量小易复性，从而使得其与基因组DNA分离；
（3）在上清液中通过酚－氯仿抽提、去垢剂或酶使剩余蛋白质变性或水解，除去蛋白质；
（4）再加入醇溶液使质粒DNA变性沉淀而与其他水溶性物质分离；
（5）将沉淀溶解于有RNase的TE溶液中，温育降解RNA后电泳检测、-20℃保存。

第18题：

简述快速氯化铯密度梯度离心法提取分离大质粒DNA的原理。

正确答案: 用氯化铯密度梯度离心分离核酸时，在高浓度氯化铯溶液中和溴化乙锭（EB.过量的情况下，EB-DNA络合物的浮力密度发生改变，改变的大小与EB结合量成反比。因此，用氯化铯密度梯度超速离心法，可分离双链RNA和单链RNA。也可分离共价闭合环状DNA与线形或带缺口的环状DNA。同时，EB-DNA络合物在紫外光下能产生荧光，可见到离心后形成的区带，便于收集DNA，所得的EB-DNA络合物用异戊醇抽提去EB，即可回收所需的DNA。此法得到的DNA纯度很高。

第19题：

质粒DNA提取后如何检测其提取质量？

正确答案:质粒DNA鉴定常用琼脂糖凝胶电泳法。它是利用琼脂糖溶化再凝固后能形成带有一定孔隙的固体基质的特性，其孔隙大小取决于琼脂糖的浓度。在电场的作用下及中性pH的缓冲条件下带负电的核酸分子就可以向阳极迁移。不同DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA主要是利用分子筛效应，其迁移速度与分子量的对数值成反比关系。此外，琼脂糖凝胶的浓度也会影响特定大小的线状DNA的迁移率，因此采用不同浓度的凝胶可以分离不同大小范围的DNA片段。染料溴化乙锭（EB）能够插入DNA分子中的碱基对之间而与DNA形成复合物，在紫外光的照射下发射荧光，且其发射的荧光强度与DNA的含量成正比。用肉眼观察，可以检测10ng以上的DNA。质粒DNA有三种构型，其中超螺旋的电泳迁移率最快。
质粒DNA的浓度测定主要有紫外光谱分析法与EB荧光分析法两种。其中紫外光谱分析法主要是根据DNA在260nm处有特异的紫外吸收峰，且其光吸收的强度与核酸的浓度成正比这一特性来推算DNA的浓度。据计算，测定该波长下DNA溶液的OD值，当OD260=1时，双链DNA含量约为50μg/ml，据此可计算出测定溶液中DNA的含量。由于蛋白质的吸收峰在280nm处，在测定DNA含量时，还常计算OD260/OD280之值，如该值为1.8—2.0时，认为已达到较高的纯度，如低于此值，表明其内含杂质较多，可能影响酶切反应。

第20题：

第21题：

第22题：

第23题：