TMB在HRP作用后由无色变蓝色，加入硫酸终止反应后呈黄色。TMB稳定性好，显色反应过程无需避光，已成为目前ELISA应用最为广泛的底物。TMB最大吸收峰是A、450nmB、275nmC、403nmD、200nmE、700nm

HRP最敏感的色原底物，在HRP的作用下显橙黄色，加强酸如硫酸或盐酸终止反应后呈棕黄色，最大吸收峰在492nm波长。其反应液稳定性差，易变色，需在配置后1小时内使用，显色反应过程需避光，且具有致癌性。4-甲基伞酮基-R-D半乳糖苷（4-MUU）常用作β-半乳糖苷酶（β-Gal）的底物，酶作用后生成高强度荧光物4-甲基伞形酮（4-MU），测量时需用荧光剂。TMB经HRP作用后变为蓝色，加入硫酸终止反应后变为黄色，最大吸收峰波长为450nm。对-硝基苯磷酸酯经AP作用后产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405nm。