原核表达载体应具备哪些基本的结构元件？

第1题：

运载体应具备哪些条件？

正确答案: ①分子量小，能结合较大的DNA片段
②能进入宿主细胞并能在其中自主复制
③外源DNA的插入不影响其复制能力
④有多种限制性内切酶的单一位点
⑤带有可供筛选的标记基因
⑥最好带有启动子，以利于目的基因的有效表达。

第2题：

标准载体应具备的基本特性是什么？

正确答案: ①在宿住细胞中能独立复制，即本身为复制子
②载体DNA分子中有一段不影响其复制的非必需区域，允许外源基因插入后随载载体DNA分子一同进行复制或扩增
③基因组中有1～2个筛选标记，赋于寄主细胞新的特性，便于重组子的筛选
④分子量小，可多次复制（拷贝），易于操作

第3题：

基因表达的主要控制元件有哪些，真核生物和原核生物有何差别？

正确答案: 基因表达的主要控制元件有启动子、核糖体结合位点、转录终止信号等。启动子：原核启动子约55bp，分为起始点（start site）、结合部位、识别部位。起始点：转录起始部位以+1表示，转录的第1个核苷酸常为嘌呤---G，A。结合部位：约6bp组成，是高度保守区，共有序列为5’-TATAAT-3’ ，位于起始点上游-10。因Tm低，DNA易解开双链，为RNA聚合酶提供场所。识别部位：约6bp组成，在-35处，为高度保守区，序列5’-TTGACA-3’， s因子识别此部位。
真核启动子于-25处含AT富集区，共有序列为TATAA（TATA box），-70处含共有序列CAAT ，还含许多其它box ，例如 GC box，E-box等。含增强子（enhancer）和静息子（silencer） RNA polⅠ和 RNA polⅢ与聚合酶Ⅱ所识别的启动子差异较大。
核糖体结合位点：在大肠杆菌等原核生物mRNA的核糖体结合位点上，含有一个转译起始密码子及同16S核糖体RNA 3，末端碱基互补的序列，即SD序列，而真核基因则缺乏此序列。
转录终止信号：在一个基因的3’端或是一个操纵子的3，端往往还有一特定的核苷酸序列，它有终止转录的功能，这一DNA序列称为转录终止子（terminator）。原核生物终止信号在结构上有一些共同的特点，即有一段富含A/T的区域和一段富含G／C的区域，G／C富含区域又具有回文对称结构，这段终止子转录后形成的RNA具有茎环结构。根据转录终止作用类型，终止子可分为两种，一种只取决于DNA的碱基顺序；另一种需要终止蛋白质（p因子）的参与。
真核生物转录终止序列，在3’端之后有共同序列AATAAA及多个GT序列，mRNA在转录终止序列处被切断。

第4题：

作为基因工程载体，其应具备哪些条件？

正确答案: 具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）；
具有合适的筛选标记；
具有较高的外源DNA的载装能力；
具有多克隆位点（MCS）；
具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。

第5题：

原核表达系统包括哪些？

正确答案:①大肠杆菌：最常采用的原核表达系统；有细胞内不溶性表达（包含体）、胞内可溶性表达、细胞周质表达；无信号肽；不存在翻译后修饰作用；存在内毒素。
②枯草芽孢杆菌：分泌能力强；不形成包含体；有很强的胞外蛋白酶，会对产物进行不同程度的降解
③链霉菌：不致病、使用安全；分泌能力强，可将表达产物分泌到胞外；有糖基化能力等

第6题：

理想的基因工程载体应具备的特征有哪些？常见基因载体有哪些？

正确答案: 特征：
①在宿主细胞内独立、稳定地自我复制。外源DNA插入其DNA之后，仍保持稳定复制能力和遗传特性。
②易于从宿主细胞中分离，并进行纯化。
③在DNA序列中有限制性内切酶单一酶切位点—位于DNA复制非必需区，在这些位点上插入外源DNA不影响载体自身DNA复制。
④有能直接观察的表形特征（报告基因），插入外源DNA后，这些特征可作为重组DNA选择标记。
常见的基因载体：
细菌质粒载体、农杆菌质粒载体、λ噬菌体载体、柯氏质粒载体和病毒载体等。

第7题：

原核生物中多基因组成的基因表达和调控元件称为（）

A、顺反子
B、操纵子
C、密码子
D、基因组

正确答案:B

第8题：

问答题

真核表达调控的顺式作用元件有哪些？其作用特点是什么？

正确答案：顺式作用元件为一些能与DBP结合的特定序列的DNA片段，决定转录起始位点和RNA聚合酶的转录效应，按功能可分为启动子、增强子、沉默子、衰减子和终止子等DNA序列片段。
启动子：真核基因启动子是基因表达时与基因转录起始有关的5’端DNA序列，包括在-30bp区富含有AT的典型TATA盒（框）（TATA box）和在-70～-80bp区域（在TATA box上游）启动元件。前者是引导RNA聚合酶Ⅱ在正确起始位点转录mRNA所必需的DNA序列，即保证转录的精确起始。后者UPE是调节转录起始频率和提高转录效率的调控序列，后者的序列常为GGTCAAT和GGGCCC序列，称为GC box，它们经协同作用，以调控基因的转录效率。
增强子：增强子是使启动子的基因转录效率显著提高（增强转录活性）的一类顺式作用元件，其本身不具有启动子活性，是由多个独立的，具有特征性的核苷酸序列所组成。其基本的核心组件常由812bp组成，以单拷贝或多拷贝串联的形式存在。增强子一般有以下特性：⑴增强子能提高同一条DNA链上基因转录的速率；⑵增强子对同源或异源基因都有效 ⑶增强子的位置可在基因5’上游、3’下游或内部；⑷无方向性，增强子从5’→3’或是从3’→5’均可对启动子发挥作用；⑸增强子可远离转录起始点；⑹增强子一般无基因特异性，对各种基因启动子均有作用，但具有组织或细胞特异性。
典型的增强子首先发现于SV40的病毒中，为SV40的早期基因增强子，约200bp，含2个72bp的重复序列，位于早期启动子上游，增强子可促使病毒基因转录效率提高100倍，因此具有这一增强子的载体已得到了广泛的应用。些年来，来自于Rous肉瘤病毒基因长末端重复序列和人类巨细胞病毒（CMV）增强子也已被广泛用于真核细胞的基因表达。增强子能增强启动子的转录能力，有效的增强子能促进转录达10倍或100倍以上，在某些情况下，表达产物可能具有细胞毒效应。因此，最好使用一种可被外界刺激信号诱导表达外源基因的诱导型启动子，诱导型启动子有热休克启动子、金属硫蛋白启动子、糖皮质激和固醇类激素诱导的启动子，热休克启动子的诱导可通过提高细胞的培养温度使启动子转录水平提高，重金属离子可有效地促进金属硫蛋白启动子的转录活性。
R.NA剪接信号：多数高等的真核基因都含有内含子序列，在细胞核内转录产生的前体mRNA要经过剪接过程去掉内含子顺序后才成为成熟的mRNA分子。虽然许多基因的cDNA转入哺乳类动物细胞后，其表达不受有或无内含子的影响，但有些基因在真核细胞中表达需要有内含子的存在。一般来说，在哺乳动物细胞的表达载体中最好有一段内含子序列的剪接信号，以提供外源基因cDNA表达的需要。常用的内含子剪接序列有SV40的小t抗原的内含子序列等。
负调控元件：沉默子和衰减子是抑制基因转录的DNA序列，称为负调控元件，它们与反式作用因子相互结合而起作用。这些负调控元件不受距离和方向的限制，并可对异源基因表达起作用。
终止子和polyA信号：核基因转录的确切终止信号和终止机制，目前尚不清楚，终止过程不是在RNA聚合酶指导下完成的，在不明机制下发生转录终止。现在已发现模板DNA分子的3’端有转录终止信号序列，称终止子。通常由转录产生的具有polyA尾的基因终止信号是在多聚腺苷酸化位点下游的一段长度为数百个碱基的DNA区域内的G/T簇，例如在SV40中的AGGTTTTTT的DNA序列为终止转录调控元件。一般转录终止子为发夹结构的反向重复序列。现在基因工程表达载体上所使用的转录终止子都是病毒基因或细胞基因的3’端的一段序列，其中也包括3’端不翻译区。如SV40小t抗原和β-球蛋白的转录终止片段常用于构建真核基因表达载体。
在双启动子的表达载体中，启动子的转录方向为同向时，上游启动的转录由于会穿过下游启动子，这样就使得下游的转录受到极大的影响，造成下游转录水平的下降，但是如果在两个启动子间插入一个转录终止子后，上游启动子对下游启动子的影响就被消除了，这样下游启动子的表达量会有明显提高。当两个启动转录方向相反时，基因表达可能会被转录形成的反义RNA所抑制，这时插入转录终止子将会消除这种抑制作用。

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第9题：

问答题

标准载体应具备的基本条件？